實時熒光定量PCR，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR技術的應用：

1. 基因工程研究領域

①　基因表達研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進行檢測，其結果特異性強、定量準確，為了解β地中海貧血的分子病理機制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數據。

②　轉基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當的循環(huán)閾值，擴增一個轉移后的基因和一個對照基因，以分析轉基因老鼠接合性。該方法為45個轉基因動物的同型結合及異質結合提供了明確的鑒定結果。通過實時定量PCR檢測，同型結合的異質接合動物交配后其子代中轉基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項技術在轉基因動物繁育及基因劑量功能效應實驗中將有很大的用途。

③　單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析：實時熒光定量PCR一個誘人的應用前景是用于檢測基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性。基因突變基于兩條探針，一條探針橫跨突變點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態(tài)性進行分析。

 

2. 醫(yī)學研究領域

①　病原體檢測：由于實時熒光定量PCR方法可靠性和重復性好，并且操作簡便、快速、結果判斷客觀，目前，人們用此方法對人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結核桿菌、巨細胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預后之間關系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標準。

②　藥物療效考核：利用實時熒光定量PCR技術檢測臨床樣品中與抗藥性相關的基因的表達。結果證明，實時熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測抗藥基因表達的可靠方法，應用這種技術可以預測化療將引起的反應。

③　腫瘤基因檢測：腫瘤的本質是細胞內基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實時熒光定量PCR方法都可以檢測出來。  目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發(fā)現。熒光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。

 

3. 其他領域

用實時熒光定量PCR方法對免疫組分進行分析是其應用的重要方面。